自発活動の非ランダム性と脳状態

Nature Neuroscienceに面白そうな論文が出ていたので読んでみる。
著者の主張は、麻酔下と覚醒中の神経集団活動は違う、ということ。

結論だけ見ればどうってことないけど、方法論と取り組んでいる問題意識が、ここ最近の研究文脈で考えるとインパクトがありそう。（そういう意味では若干マニア向け？このエントリーは超マニア向け。）

何をしたかというと、覚醒中と麻酔中のラット視覚野２/３層の神経集団活動（カルシウムの濃度変化）をtwo photonイメージングで解析している。全く同じ神経集団から、覚醒中（意識アリ）と麻酔下（意識ナシ）で活動を可視化したところが新しい、と思われる。

解析に関しては、神経集団活動はランダムか、否か？という視点から、単一細胞、細胞ペア、細胞集団という各レベルで定量的に解析している。目のつけどころも良い。

研究の結果、脳状態によらず神経集団は非ランダム的な活動をしていて、麻酔中の集団活動は、覚醒中のそれとは全然違う、ということを主張している。

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イメージング独自の細かい解析はフォローできない。だからなのか、？？と思う点がたくさんあったので、つぶやきモード炸裂で、各図の説明とツッコミを、久々に（？）コッテリいってみます。（もし同じ論文を読んだ方がいたら、問題意識をシェアしましょう。）

＊ひどいジャーゴン（専門用語）をできるだけ避けるようにしましたが、完全には無理でした。（すみません。。。）

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覚醒中と麻酔中のスパイク発生確率

図１　カルシウムシグナルとそこから推定したスパイクの発生確率を、覚醒中と麻酔中で比較している。主張は、麻酔（ケタミン）をかけると発火頻度が下がる、ということ。

パネルa：実験風景。

パネルb：イメージングしている細胞の例。（ツッコミ１、以下参照）

パネルc：覚醒中と麻酔下のカルシウムシグナル。（ツッコミ２）

パネルd：イメージング中にcell-attached記録をしている様子。

パネルe：カルシウムシグナルを元に信号を推定して、それ（カルシウムスパイク）と電気的なスパイクとの対応を示している。

パネルf：スパイク推定アルゴリズムのキャリブレーション。ニューロンが１０Hz以下で発火してくれるなら、９０％以上と高精度で推定可能。（ツッコミ３）

パネルg：推定スパイクをもとに、覚醒中（運動中と静止中で区別）と麻酔中の発火頻度を比較している。麻酔中では、発火頻度が有意に低いことが分かった。

パネルh：各細胞の発火頻度の変化。麻酔をかけるとほとんどの細胞で発火頻度が下がっている。（ツッコミ４）

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ツッコミ１：上下の写真はおそらく覚醒中と麻酔中という意味だろう。一回の実験あたり、平均で17.6個同時記録できたとある。感覚的には１６チャンネルの多点電極の記録、それを比較的高密度でやる感じ？（スパイクオーバーラップの問題を気にせず細胞ペアの解析ができるのはうらやましい）（追記7/7:けど、時間解像度は96msなので、それ以前の問題が山積してはいるか。自己ツッコミ）

ツッコミ２：麻酔下でSN比が悪くなっているのがやや気になる。偽陰性シグナルが麻酔下で増えたら、この図の残りの主張（発火頻度の低下）はかなり弱くなる。

ツッコミ３：アルゴリズムをしっかり理解していないけど、このキャリブレーション結果からすると、図２のバースト解析は過小評価していないか？なぜなら、電気信号を計測している人たちの「バースト」は、定義をゆるくしても、通常10ms以下での連続的発火を扱ってる気がするから。

それから、カルシウムスパイクと電気スパイクのキャリブレーションは麻酔下でやっているようなので、もしケタミンによってカルシウムシグナルの発生方法が何らか変化すると（ケタミンはNMDA受容体に働くから変わる気もする。。。あいたたた。。。）、そのキャリブレーションは覚醒中のデータには適用不可というリスクがある気がする。

覚醒中にスパイク記録することは無理だったのか？大変なのはわかるけど、ここまでやってるならできる気も。。。

ツッコミ４：ホントならかなりインパクトのあるデータだけど、パネルcの脳状態によるSN比の違い、パネルfから予想されるバーストの過小評価のリスク、推定アルゴリズムのエラーなど、いろんなファクターが誤差を生みそう。

例えば、麻酔中、活動する時は集中的に10Hz以上で激しく活動したりすると、如何に「バースト」イベントの発生確率が覚醒中と比べても低いといっても、バーストあたりのスパイク数までしっかり測れていないことになる。

とすると、実際のスパイク数はガラッと変わる。しかも麻酔中はUp&Down状態だろうし、Up中は、刺激呈示した時のように数十Hzで発火してても全然不思議ではない。

一歩譲って傾向（麻酔中は発火頻度が低い）は良いとしても、厳密な定量性での信憑性は少し疑った方が良いか？

特にsupplementary fig 4を出してきているのは、結構ショッキング。。。偽陽性は低いという記述はあるが、データ解析が非常に大変そうなSN比の低さ。。。視野としてとらえられている細胞サイズなども信号検出に影響しないかと素人的に思った。

最後に、視覚野を対象にしているので、眼球運動の違いでこのデータを説明できてしまうリスクはないか？（とすると純粋な自発活動を見ていると言えるか？？）。覚醒中、眼球をたくさん動かして、その眼球運動に対する活動が毎回発生したりすると（ホントにスパイクが発生するのか、自分は知らないけど）、覚醒vs麻酔という比較ではなく、単に眼球運動というパラメーターで説明できてしまう。。。

という感じで、インパクトだけで今後この分野をmisleadしないかやや心配。特に、麻酔実験嫌いな人が、こういう問題点を汲みもせず、彼らの主張だけを多用したりしそう。。。自分の勘違い、誤解なら良いが。。。

ただし、発火頻度１Hz以下の細胞が大多数、という事実は超重要。

一部の論文で、１Hz以下の細胞はデータ解析から切り捨て、もしくはサンプリングすらしない、なんて（ひどい）バイアスをかけたりするから、この事実は知っておいたほうが良い。脳はそんなにエネルギー浪費家ではない（というのが個人的意見。ホントかどうかは実際のところ１００％sureではないです。。。。）


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主に単一細胞レベルの非ランダムな活動

図２　スパイク時系列はランダム（ポアソン的）か？、それは脳状態で違うか？という問題に取り組んでいる。

ここでは、二つの指標でランダムかどうか調べている。
まず、細胞ペアの活動相関、そして単一細胞レベルの「バースト」の発生確率。つまりは、スパイクを出すタイミングに偏りがあるかどうか、調べている。

主張は、どちらの脳状態でもランダムではなく、麻酔をかけるとバーストが減る、ということ。

パネルa：細胞ペアの活動相関を一部解析（ツッコミ１）。１個の細胞の発火タイミングを基準にして、他の細胞たちがその前後でどれくらい活動したかを調べている。

もしランダムなら、偏りのない、フラットな分布になるはずだけど、時間差ゼロ付近に他の細胞のスパイクも偏っている。ということで、細胞たちはランダムではなく、同時期（１００ミリ秒単位）に活動している傾向がある、という解釈になる。

パネルbに入る前にsupplementary Fig 9：麻酔中でも覚醒中でも、ランダムではなく、スパースな活動をし、覚醒中は麻酔中よりスパースな活動をしていた、ということを示している。

ここでは、いわゆる「ライフタイム・スパースネス」を計算している。これは、計測期間（ライフタイム）にわたって、１細胞のスパイク発生確率の分布が、どれくらい偏りのある分布になるか測る指標。もしランダムな発火をするなら（ポアソン：平均と分散が同じ）なら、図中、緑線になる。けど、それより上（スパース）だったということになる。

このデータは、スパイクが特定の時間帯に集中する「バースト」が起こっていたことを意味していそう。

ということで
パネルb：ここでは、その「バースト」を解析している。覚醒中は麻酔中より「バースト」がたくさん発生していた、ということを言っている。（ツッコミ２）

パネルｃ：覚醒中と麻酔中のバースト発生確率の比較。覚醒中にバーストがたくさん発生していたという主張。

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ツッコミ１：ここでは１個体分、しかも１細胞を基準としたデータだけを示している。図３でしっかり全ペアの相関解析をやっているのに、このパネルは必要だったのか？、もしくは図３に入れたほうが良くないかい？と思ってしまう。このあたりの話の持っていき方、若干わかりづらいか。

単一細胞→細胞ペア→細胞集団と少しずつステップアップさせる書き方のほうが良い気がした（レフリーのクレームで、単一細胞レベルでスパースネスとバースト解析をしろ、といわれて付け足して、その結果わかりにくくなったのかも。。。もしそうなら同情。）

ツッコミ２：彼らのバーストの定義、どうなんだろう？上のライフタイム・スパースネスの計算法に乗っ取って、Poissonと仮定した時より、どれくらい分布が偏っているか（単純に二つのスパースネス計算の差）をburst indexとしているようである。

こういうバーストの測り方、初めてみた。一見エレガントのようにも見えるけど、なんかだまされてる気分。。もうちょっと具体的なイメージをもてるように考えてみよう。。。

ちなみに、彼らの使っている時間ビンのサイズは192msらしい（２フレーム分）。こんなに広くとって「バースト」を議論して良いのだろうか。。。おそらく、最近のサックマンラボの話が伝わっていて、電気スパイク的にも正しそうだしOK、という勢いなのかもしれない。。。（発火頻度に関しては主張が食い違ってるけど。。。）

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細胞ペアと細胞集団レベルの非ランダムな活動

図３　細胞ペア、細胞集団レベルでの解析。主な主張は、麻酔中、細胞集団の活動は覚醒中より相関している（一緒に活動している）ということ。（ツッコミ１）

パネルa：覚醒中の計測イメージに、細胞活動の相関性をマップしている。（ツッコミ２）

パネルb：全ペアの相関を、３つの脳状態（運動中、静止中、麻酔中）で比較すると、相関性は麻酔＞静止＞運動の順で高いことがわかった。（ツッコミ３）

パネルc：各ペアの相関が麻酔中と覚醒中でどう変化するか調べている。どちらかの状態で相関性が高かったペアは、必ずしも他の脳状態でもそうとは限らない、ということになる。（ツッコミ４）

パネルd：細胞ペアレベルで発火頻度と相関性の関係を調べている。麻酔中は、細胞ペアの発火頻度が高いほど、相関性も高くなるけど、覚醒中、細胞ペアの発火頻度に依存しない。（ツッコミ５）

パネルe：細胞集団のスパイクパターンがどれくらい非ランダム的で、それがバーストと相関活動でどれくらい説明できるか調べている。覚醒中の非ランダム性の大半はバーストに由来しているけど、麻酔中のそれは活動相関も大きく寄与している、ということ。（ツッコミ６）

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ツッコミ１：麻酔中はUp&Down状態だし、結論そのものは全く新しくない気もする。。。もし同じくUp&Down状態の睡眠中と麻酔中は実は違う、ということがわかると、かなりショッキングな結果になる。。。

ツッコミ２：論文の図をセクシーに見せたいのはわかるけど、この図にあまり意味はない。。。むしろsupplementary fig 8の方を格上げすべき。その図では、相関性は細胞間の距離には依存しないということを示していて（結論付けられないのかもしれないけど）、バレル皮質とは違う結果になっている。Ohkiさんたちの論文とも相性が良い。自発活動レベルでも活動の相関性が細胞距離と独立だとすると、呈示刺激以前の話だから、げっ歯類（少なくともラット）の視覚野は、とんでもない原理で構成されているのかもしれない。。。超面白いネタが眠っている。

ツッコミ３：上述のように、静止中のおそらく一部と麻酔中でUp&Down状態になっているだろうから、あまり驚きはない。

ツッコミ４：おそらく今回の論文で最も意味のありそうなデータの一つ。このデータは超面白い！けど、どう解釈をしたら良いか？セルアセンブリ！と安易には言いたくない。けど、現象的には、セルアセンブリのように文脈依存的に機能的ネットワークを形成しているイメージは悪くない気がする。このデータをもっと掘り下げられたらNatureクラスいけるな。

（追記7/7：これに関してはそう楽観的な議論はできないです。すみません。コメント欄のkannさんとのやりとりをどうぞ）

ツッコミ５：このデータも超面白い。ちなみに、細胞ペアの発火頻度の指標として、geometric meanを使っている。これはReyes研の仕事にインスパイアされているから。驚きは、覚醒中、Reyesたちの発見が破れてしまう（追記7/7:「破れる」というのは誤りです。むしろ、その論文の予測とフィットするとも考えられます。完全に私の誤解です。）、ということ。この統計データの中で何が起こっているのか、もう一つ飲み込めない。著者たちは何も解釈していなようだし。。。

（追記7/7：これに関してもkannさんとのやり取りを参照下さい。）

ツッコミ６：この解析はSchneidman論文にインスパイアされている。バーストと相関を除いたモデルと比較して、非ランダム性のメカニズムを説明しているところがミソ。図２と図３の総まとめ的なデータと思ったら良いのか？（追記7/7：ちなみに、ここで示しているのは１データセットのみと理解した。もしそうなら、他のデータでも再現がとれているのかは不明）

実際の計算では、相当手の込んだ解析をしっかりやっている感じで、相関を取り除くためにindependent multinomial distribution、バーストを取り除くためにcorelated Poisson、両方を取り除くためにindependent Poissonをモデルとして解析している。

さらに、少ないサンプル数によるオーバーフィッティングを避けるためのregularizationもしっかりやっているようだ（詳細はsupplementaryに）。

という感じで、単純に見えるような解析だが、相当コンピューターに頑張ってもらっている感じ。解析のプロだな。。。

ちなみに、時間窓は２フレーム分192msで解析している。Schneidman論文は確か２５msだったと記憶してるから（追記7/7：正しくは２０ms）、相当粗い時間解像度ということにはなる。


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最後の結論部分では、麻酔中は、バーストモードから相関モードに切り替わって、活動の伝播様式がガラッとかわる、ということを言っていて、麻酔中の神経集団活動から覚醒中のそれを直接推測するのは無理がある、という主張をしている。

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何を学ぶ？

この論文、図１，２を見た時は結構イタいと思ったけど、図３はなかなか面白い（もう少し踏み込め、という気もするけど）。Nature Neuroscienceに載る価値はあると思った。

麻酔はダメ、という主張のためだけなら、覚醒→麻酔で悪くないけど、サイエンティフックな問題意識（神経集団の情報処理）なら、覚醒→睡眠と無ドラッグ状態で見た方が良い。

今後の方向は、ここで見つけたこと（図３c, dとsupplementary fig 8）を他の方法（特にもう少し時間解像度の良い方法）でも追試しながら、何が起こっているのか、もっともっと掘り下げて行く方向が一つ。

今回は視覚野2/3層の話なので、他の領野ではどうかという水平方向に一般化させる方向も一興。
そして、垂直方向に一般化させる方向は超重要。

さらに、細胞種で解析し分けて回路をdissectしながら、全体の情報処理を考えていく方向も魅力的。

解析方法そのものは、最後の解析はパターン認識・機械学習のセンスが必要そうだけど、自分でも頑張れば理解できそうな閾値付近か（少し時間をかけて勉強してみよう）。一部気に食わない部分はあれど、好きな論文の部類か（ツッコミたおしたけど）。

テキストとしては、イントロ部分と結論部分は良く書けていると思われる。

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紹介した文献
Nat Neurosci. 2008 Jul;11(7):749-751. Epub 2008 Jun 15.
Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.
Greenberg DS, Houweling AR, Kerr JN.

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